Échantillons biologiques & ; désintégration cellulaire

De la désintégration cellulaire à la pulvérisation et à l'homogénéisation des échantillons biologiques les plus divers

La préparation d'échantillons biologiques tels que les os, les plantes, les muscles ou les crachats pour l'analyse de l'ADN, de l'ARN, des protéines ou des métabolites peut s'avérer être un défi. RETSCH propose des broyeurs de laboratoire qui pulvérisent et homogénéisent les échantillons solides, mais qui sont également adaptés à la désintégration cellulaire. Les broyeurs RETSCH sont utilisés, entre autres, dans les domaines de la biotechnologie, du diagnostic, de la médecine légale, de l'agriculture et de la microbiologie.

Désintégration cellulaire de micro-organismes (en suspension)

La désintégration cellulaire est souvent la méthode privilégiée pour extraire les composants cellulaires des bactéries, des levures, des champignons ou des microalgues, et est réalisée soit par des moyens chimiques, soit par des moyens mécaniques. Les méthodes mécaniques conviennent mieux aux cellules dont les parois sont tenaces ou lorsque les produits chimiques pourraient nuire à l'extraction et doivent donc être évités.

Une méthode courante et efficace est le bead beating, qui consiste à cisailler les cellules en suspension à l'aide de billes. Le bead beating peut être réalisé à petite ou à grande échelle dans différents flacons ou tubes. Il est possible de mélanger la suspension avec des billes et d'utiliser un mélangeur à vortex. Cependant, cette méthode est lente et incohérente, en particulier si le nombre d'échantillons est important ou si les temps de désintégration sont longs. L'utilisation de RETSCH vibro-broyeurs avec des adaptateurs qui automatisent le processus et le rendent rapide, efficace et reproductible, permet d'obtenir de meilleurs résultats.

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Vibro-broyeur MM 400 - Désintégration des cellules de levure*

_{*La vidéo montre le modèle précédent avec un principe de fonctionnement identique.}

^{Reproductibilité accrue de la concentration en protéines totales après digestion cellulaire, 7 min en MM 400, 12 min vortex ; barre d'erreur : % écart-type}

La MM 400 traite jusqu'à 20 échantillons dans des tubes Eppendorf de 1,5 ou 2 ml, avec un gain de temps et sans contamination croisée. De plus, un adaptateur est disponible pour accueillir jusqu'à huit tubes Falcon de 50 ml. La taille optimale des billes pour la désintégration cellulaire dépend du type de cellule ; pour les bactéries et les levures, il est recommandé d'utiliser des billes de verre d'un diamètre de 0,75 à 1,5 mm, tandis que pour les champignons et les microalgues, des billes plus petites, de l'ordre de 0,1 à 0,5 mm, sont plus appropriées.

Pour l'extraction d'ADN ou d'ARN, les petits tubes jetables jusqu'à 2 ml sont parfaitement adaptés, tandis que les grands récipients comme les Falcontubes de 50 ml conviennent bien pour le traitement des protéines ou des métabolites. Les paramètres optimaux de bead beating varient en fonction du type de cellule. Il peut être nécessaire de faire quelques essais pour obtenir les meilleurs résultats. En général, 30 secondes (la plupart des microalgues) à 7 minutes (les levures en général) de bead beating sont nécessaires pour casser complètement les cellules.

En accueillant jusqu'à cinquante récipients jetables de 2 ml, les broyeurs vibrants comme le MM 500 vario effektiv augmentent le débit d'échantillons.

Cellules de Phaeodactylum tricornutum avant (à gauche) et après la désintégration cellulaire (à droite) avec le vibro-broyeur MM 400 en combinaison avec l'adaptateur Falcontube.

Contrôle de la température pour le bead beating en suspension cellulaire

La température joue un rôle crucial, en particulier dans les applications impliquant des protéines sensibles à la température. Il existe une solution, le broyage cryogénique (voir paragraphe correspondant), et une autre, le refroidissement de la suspension cellulaire.

Pour la MM 400, il a été démontré que l'augmentation de la température dans les tubes de 2 ml est modérée, même à 30 Hz ; un moyen simple consiste à faire des pauses de plus d'une minute, pendant lesquelles l'adaptateur avec les tubes est refroidi pendant une minute dans un bain de glace. De cette manière, la température reste inférieure à 12-15°C, en fonction de la taille des billes utilisées.

^{Montée en température pendant la digestion cellulaire dans le MM 400 (à 30 Hz) ou avec un vortex, refroidissement sur glace après chaque minute de digestion cellulaire}

Pour contrôler l'évolution de la température lors du bead beating, il est possible d'utiliser le broyeur vibrant MM 500 control. Un adaptateur spécial accueille dix-huit flacons de 2 ml à usage unique par lot. La machine est reliée à un refroidisseur d'eau réfrigérée à 4°C, qui refroidit à son tour l'adaptateur qui reçoit les flacons. De cette manière, la température de la suspension est maintenue à environ 13°C, sans les fastidieuses phases d'interruption manuelles dans un bain de glace. Bien que le MM 500 control ne puisse pas être utilisé avec l'adaptateur Falcontube à usage unique, il peut être utilisé avec des récipients de broyage en acier inoxydable d'un volume de 50, 80 ou 125 ml (voir exemple à gauche : P. pastoris).

Si le broyeur fonctionne avec de l'azote liquide et le CryoPad et est réglé sur une température de 0°C, la température de la suspension cellulaire dans des tubes jetables de 2 ml peut même être maintenue à 0°C sans que la suspension ne gèle, ce qui permet de continuer à réaliser un bead beating efficace.

Homogénéisation d'échantillons biologiques mous et tenaces

Il est parfois difficile d'homogénéiser complètement certains échantillons biologiques, comme les crachats de patients atteints de mucoviscidose ou les échantillons de tissus comme le foie, les poumons ou les tumeurs. Les récipients jetables de 2 ml sont souvent trop petits pour contenir le volume total de l'échantillon, de sorte que l'échantillon doit être divisé et réuni après le processus d'homogénéisation, ce qui représente une charge de travail et un temps supplémentaires pour les laborantins.

Les récipients de broyage plus grands en acier inoxydable, par exemple, peuvent contenir le volume total de l'échantillon, mais doivent être nettoyés après chaque utilisation. Un adaptateur pour le broyeur vibrant MM 400 permet de résoudre ce problème en permettant l'utilisation de 5 tubes jetables de 5 ml, qui offrent une plus grande capacité et ne doivent pas être nettoyés. Dix échantillons peuvent être homogénéisés simultanément par lot. Pour l'homogénéisation d'échantillons de tissus, il est également possible d'utiliser des Falcontubes de 50 ml. Dans ce cas, 8 échantillons par lot peuvent être traités en quelques minutes seulement.

Échantillon de foie avant et après homogénéisation dans le MM 400

Broyage cryogénique d'échantillons biologiques

Certains échantillons biologiques, comme les plantes fibreuses, les veines visqueuses, les ongles ou les tissus animaux ou tumoraux, sont difficiles à homogénéiser dans un système tampon. Ils sont soit trop mous, soit trop durs ou trop fibreux pour être pulvérisés efficacement dans la suspension. Une meilleure alternative pour ces échantillons est le broyage cryogénique, qui consiste à les congeler avec de l'azote liquide avant ou pendant le broyage. Cette technique fragilise les échantillons, qui peuvent alors être facilement réduits en poudres homogènes. Le broyage cryogénique présente également l'avantage de préserver l'intégrité des protéines ou des composés volatils, par exemple, qui pourraient se décomposer ou s'évaporer à des températures plus élevées. En outre, le broyage à basse température permet de briser les organelles intracellulaires de certains organismes, comme la levure.

Pour les échantillons collants, comme les baies, le broyage cryogénique est souvent la seule méthode viable pour obtenir un échantillon homogène. Le tableau présente quelques exemples de matériaux d'échantillons qui ont été traités avec succès par broyage cryogénique dans le broyeur vibrant MM 400 ou le CryoMill. Il est possible d'utiliser des récipients en acier de 2 ml pour le broyage cryogénique dans le MM 400. Des effets similaires peuvent être obtenus dans le MM 500 control avec des récipients de broyage jusqu'à 125 ml pour des quantités d'échantillons plus importantes. Dans ce cas, il faut utiliser le CryoPad pour travailler avec de l'azote liquide. Pour les volumes d'échantillons plus petits, des récipients en acier inoxydable de 2 ml avec les adaptateurs correspondants sont également proposés pour tous les broyeurs mentionnés.

^{Tubes à essai de 2 ml en acier inoxydable}

Echantillon	Accessoires	Charge d'alimentation	Durée de broyage	Vitesse	Finesse finale max. (d90)/
E. coli Bactéries	2 bols de broyage en acier inoxydable 50 ml 2 billes de broyage 25 mm en acier inoxydable par bol	2 x 10 ml de boulettes de cellules congelées	2 min	30 Hz	désintégration complète des cellules
tissu musculaire	Bol de broyage 50 ml, acier inoxydable Bille de broyage 25 mm, acier inoxydable	10 g	4 min	25 Hz	<150 µm
aiguilles de pin	2 adaptateurs pour dix microtubes de 2 ml chacun Pour chaque microtube, deux billes de broyage de 5 mm, acier inoxydable		3 min	30 Hz	Extraction d'ARN reproductible à partir de 20 échantillons en une seule étape
berries	Bol de broyage 50 ml, acier inoxydable 4 billes de broyage 15 mm, acier inoxydable	2 g	40 secs	20 Hz	<200 µm
finger nails	Adaptateur CryoMill pour 4 récipients de 2 ml Par récipient 4 billes de broyage en acier inoxydable 5 mm	1 ongle par récipient	2 min	25 Hz	<200 µm
intestin de rat	Bol de broyage 35 ml, acier inoxydable 1 boule de broyage 20 mm acier inoxydable,	1.8 g	2 min	30 Hz	<150 µm

^{Morceaux de viande avant et après le broyage cryogénique}

^{Baies collantes avant et après le broyage cryogénique}

^{Aiguilles de pin avant et après le broyage cryogénique}

^{Gel d'agarose pour la séparation de l'ARN des aiguilles de pin homogénéisées ; reproductibilité élevée, quantité suffisante d'ARN préparé}

Échantillons médico-légaux

Les échantillons médico-légaux tels que les cheveux, les os et les dents sont généralement fragiles et ne doivent donc pas être refroidis avant d'être pulvérisés. Pour obtenir la finesse analytique souhaitée, les échantillons doivent éventuellement être pré-broyés dans un concasseur à mâchoires ou un broyeur à couteaux pour réduire leur taille de particules ; pour être ensuite traitées dans un broyeur à billes à moins de 10 mm. Les broyeurs à couteaux sont utilisés pour le pré-broyage des os, qui sont frais et ne peuvent pas être complètement secs et peuvent même contenir des restes de viande.

RETSCH propose une gamme de broyeurs à couteaux pour le pré-broyage de matériaux d'échantillons mous, mi-durs, élastiques, tenaces et fibreux. Les nombreux accessoires permettent une adaptation optimale aux différentes applications. Le SM 300 peut être équipé de trois rotors différents et de tamis de fond de 0,25 ; mm à 20 mm. Contrairement aux os frais et gras, les os secs peuvent être réduits à une taille inférieure à 0,25 mm en une ou deux étapes. La SM 300 présente une vitesse variable de 100 à 3.000 min^-1. La suite du broyage des os, des dents ou des cheveux se fait généralement dans des broyeurs à billes avec des billes de broyage > ; 5 mm en acier, en oxyde de zirconium ou en carbure de tungstène.

^{Échantillon d'os avant et après broyage dans un broyeur à couteaux}

^{Cheveux humains avant et après le broyage dans un vibro-broyeur}

Procédé d'obtention de cellules bactériennes intactes à partir de tissu humain

L'une des complications possibles des opérations de remplacement des articulations, par exemple au coude ou au genou, est l'infection des tissus environnants par des bactéries. Ces infections, appelées infections de prothèses (PJI), peuvent survenir de quelques jours à plusieurs années après l'opération. Elles sont difficiles à traiter, car elles peuvent être causées par différents types de bactéries et ne sont pas toujours détectées par les méthodes traditionnelles. Il est donc nécessaire d'isoler les bactéries des échantillons de tissus de manière à préserver leur viabilité et à pouvoir les identifier et les cultiver.

C'est là que le broyeur vibrant MM 400 peut s'avérer utile grâce à une procédure simple : Les échantillons sont mélangés avec 20 ml d'eau déminéralisée stérile et 5 ml de billes de verre de 1 mm dans un récipient en acier stérilisé. Il est possible d'utiliser des flacons à col large de 30 ml à usage unique. Jusqu'à 8 flacons sont agités pendant 3,5 minutes à 30 Hz afin d'éliminer les bactéries des échantillons sans les détruire. Les bactéries peuvent ensuite être facilement cultivées sur une plaque de gélose pour une analyse ultérieure. Cette méthode a un taux de détection élevé (A.-L. Roux et. al 2010) et peut être appliquée à tout échantillon de tissu solide infecté, même s'il contient du matériel implanté.

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